Khi số vi sinh vật trong mẫu quá thấp để đếm trên đĩa, khi mẫu chứa nhiều cặn làm khó quan sát khuẩn lạc, hoặc khi vi sinh vật cần được nhận biết bằng phản ứng sinh khí, sinh axit, phòng thí nghiệm thường dùng một phương pháp có lịch sử hơn một thế kỷ: MPN – số có xác suất lớn nhất.

MPN là gì?

MPN (Most Probable Number) là phương pháp ước tính thống kê mật độ vi sinh vật trong mẫu dựa trên kết quả dương tính hoặc âm tính của nhiều ống môi trường lỏng được cấy các lượng mẫu khác nhau. Thay vì đếm trực tiếp khuẩn lạc như phương pháp CFU, MPN dựa trên xác suất: lượng mẫu càng lớn thì khả năng ống nhận được ít nhất một vi sinh vật càng cao.

Nguyên lý thống kê

Phương pháp giả định vi sinh vật phân bố ngẫu nhiên trong mẫu theo phân bố Poisson, và mỗi ống chứa ít nhất một tế bào sống sẽ cho kết quả dương tính (đục, sinh khí, đổi màu). Từ tổ hợp số ống dương tính ở các độ pha loãng, có thể tính được mật độ vi sinh vật có xác suất cao nhất đã tạo ra kết quả đó. Trong thực tế, các phòng thí nghiệm tra bảng MPN đã được tính sẵn hoặc dùng phần mềm.

Quy trình phổ biến

  1. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân của mẫu (ví dụ tương ứng 0,1 g; 0,01 g; 0,001 g mẫu mỗi ống).
  2. Cấy vào dãy ống: mỗi độ pha loãng cấy vào 3 ống (hệ 3 ống) hoặc 5 ống (hệ 5 ống) chứa môi trường lỏng chọn lọc, thường có ống Durham để thu khí.
  3. Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định.
  4. Ghi nhận ống dương tính (đục, sinh khí, đổi màu) ở mỗi độ pha loãng.
  5. Khẳng định: cấy chuyển từ ống dương tính sang môi trường khẳng định để chắc chắn đúng nhóm vi sinh vật mục tiêu.
  6. Tra bảng MPN theo tổ hợp số ống dương tính khẳng định, nhân với hệ số pha loãng nếu cần.

Ví dụ tra bảng

Với hệ 3 ống, cấy lần lượt 0,1 g; 0,01 g; 0,001 g mẫu, kết quả dương tính là 3 – 2 – 0 (cả 3 ống ở mức 0,1 g, 2 ống ở mức 0,01 g, không ống nào ở mức 0,001 g). Theo bảng MPN của FDA BAM, giá trị MPN tương ứng khoảng 93 MPN/g, với khoảng tin cậy 95% khoảng 18–420 MPN/g. Ví dụ này cho thấy khoảng tin cậy của MPN rất rộng.

Ứng dụng

  • Coliform và coliform chịu nhiệt: phương pháp MPN theo ISO 4831 (tương đương TCVN 4882) dùng canh LST, khẳng định bằng canh BGBL; vẫn được dùng rộng rãi cho thực phẩm và nước.
  • E. coli: ISO 7251 cho thực phẩm; ISO 16649-3 cho nhuyễn thể hai mảnh vỏ sống, là phương pháp tham chiếu để phân loại vùng thu hoạch nhuyễn thể theo quy định EU.
  • Nước uống, nước sinh hoạt, nước nuôi trồng: nhiều quy chuẩn chấp nhận kết quả MPN/100 ml.
  • Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus khi mật độ dự kiến thấp.
  • Mẫu có cặn, thực phẩm dạng hạt, bột làm khó đếm đĩa.
  • Hệ thống MPN tự động (ví dụ dùng thẻ nhiều giếng nhỏ, đọc huỳnh quang) đếm tổng số, coliform, E. coli, nấm men – mốc với ít thao tác hơn.

Ưu điểm

  • Độ nhạy cao khi mật độ thấp: cấy được lượng mẫu lớn (1 g, 10 g trong một ống) mà đĩa thạch không chứa nổi.
  • Phù hợp với vi sinh vật bị stress: môi trường lỏng giúp tế bào tổn thương phục hồi tốt hơn môi trường thạch chọn lọc.
  • Dùng được cho mẫu nhiều cặn, có màu gây khó quan sát khuẩn lạc.
  • Thiết bị đơn giản.

Hạn chế

  • Độ chính xác thấp: khoảng tin cậy rộng, thường kéo dài từ khoảng một phần ba đến gấp ba hoặc hơn giá trị MPN với hệ 3 ống. Hệ 5 ống chính xác hơn nhưng tốn công hơn.
  • Tốn nhiều ống, môi trường, thời gian (thường 2–4 ngày tính cả khẳng định).
  • Một số tổ hợp kết quả có xác suất thấp (ví dụ 0 – 0 – 3) cho thấy sai sót kỹ thuật hoặc phân bố bất thường, cần làm lại.
  • Không phân lập được khuẩn lạc riêng ngay từ đầu.

So sánh MPN và đếm đĩa

  • Đếm đĩa: chính xác hơn khi mật độ trung bình đến cao, cho kết quả CFU, thao tác ít hơn.
  • MPN: phù hợp mật độ thấp, mẫu khó, vi sinh vật bị stress; kết quả là ước tính thống kê.
  • Hai đơn vị MPN/g và CFU/g có ý nghĩa tương tự nhưng không hoàn toàn tương đương; khi so sánh với giới hạn quy chuẩn, cần dùng đúng phương pháp và đơn vị mà quy chuẩn chỉ định.

Thiết kế thí nghiệm MPN hợp lý

Để kết quả MPN có ý nghĩa, dãy pha loãng phải được chọn sao cho ống ở độ pha loãng thấp nhất phần lớn dương tính và ống ở độ pha loãng cao nhất phần lớn âm tính. Nếu dự kiến mật độ rất thấp (ví dụ kiểm tra nước đã xử lý), có thể cấy lượng mẫu lớn như 10 ml hoặc 10 g vào môi trường nồng độ kép. Nếu chưa biết mật độ, nên cấy nhiều độ pha loãng hơn ba mức. Kết quả cần được kiểm tra tính hợp lý thống kê; các bảng MPN hiện đại có ghi chú những tổ hợp có xác suất xảy ra thấp để phòng thí nghiệm cân nhắc làm lại.

Đọc kết quả MPN

  • Kết quả “< 3 MPN/g” (hệ 3 ống) nghĩa là không có ống nào dương tính, dưới giới hạn phát hiện của thiết kế thí nghiệm.
  • Kết quả “> 1.100 MPN/g” nghĩa là tất cả ống dương tính, cần pha loãng thêm để có giá trị chính xác.
  • Nên ghi kèm khoảng tin cậy khi dùng kết quả cho quyết định quan trọng.

Câu hỏi thường gặp

Vì sao MPN vẫn được dùng khi đã có phương pháp nhanh? Vì nhiều quy chuẩn, đặc biệt cho nước và nhuyễn thể, vẫn chỉ định MPN là phương pháp tham chiếu; MPN cũng có lợi thế với mật độ thấp và vi sinh vật bị tổn thương.

Kết quả MPN 3,6 MPN/g có nghĩa là có đúng 3,6 vi khuẩn trong mỗi gam? Không. Đó là ước tính có xác suất cao nhất; mật độ thực có thể nằm trong khoảng tin cậy rộng quanh giá trị này.

Thuật ngữ liên quan

Đọc thêm: Ngành Công Nghệ Thực Phẩm Là Gì? Tổng Quan A-Z