Ở bài viết này, tác giả sẽ hướng dẫn một số quy trình phân tích phụ gia trong một số nền mẫu thực phẩm trong serie bài viết xác định và phân tích phụ gia thực phẩm.
Quy trình phân tích phụ gia trong một số nền mẫu thực phẩm
Định lượng 2,4-diaminoazobenzene và orange ii trong nền mẫu thịt bằng phương pháp hplc-uv
Hóa chất
Chuẩn tinh khiết: Orange II (độ tinh khiết 99,9 %) của hãng Dr. Ehrenstorfer. Chuẩn 2,4-diaminoazobenzene hydrochloride (độ tinh khiết > 99%) của hãng SigmaAldrich Acetonitrile của hãng J.T.Baker dùng cho HPLC, MgSO4, CH3COONa, CH3COOH, HCOOH , HCOONa của Merck, hỗn hợp bột PSA (primary secondary amine) và C18 của hãng Agilent để thực hiện giai đoạn clean-up trong kỹ thuật chuẩn bị mẫu theo QuEChERS.
Chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn gốc đơn của từng chất Orange II, DAB có nồng độ 1000 mg/L trong acetonitrile.
Chuẩn hỗn hợp trung gian của Orange II, DAB có nồng độ 50, 100, 200 mg/L được pha loãng từ chuẩn gốc.
Hỗn hợp chuẩn làm việc được xây dựng với nồng độ 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 ,1, 2, 5, 10, 20 mg/L.
Quy trình xử lý mẫu
Phương pháp QuEChERS theo AOAC 2007.01 được tham khảo. Cân khoảng 5 g mẫu đã được đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL. Mẫu được chiết trong giai đoạn một với 15mL dung dịch 1 % acid acetic trong acetonitrile + hỗn hợp muối (MgSO4: 6 g + CH3COONa : 1,5 g), lắc trong 2 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. chuyển toàn bộ dung dịch thu được qua ống ly tâm khác có chứa 0,15 g PSA và 0,15 g C18, lắc trong 1 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 5mL lớp dung dịch phía trên cô quay và định mức lại bằng 1 mL acetonitrile. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, cho vào lọ thủy tinh 1,5 ml và tiêm vào máy HPLC-UV.
Điều kiện HPLC-UV
Thiết bị HPLC-UV 20AD SHIMAZU được sử dụng để phân tích đồng thời DAB và Orange II.
Điều kiện cho HPLC-UV:
- Cột phân tích: GL Sciences Inc C18 (250 mm × 2,1 mm, 4,6 µm)
- Pha động : A:B (20:80) (A là Acetonitrile, B là dung dịch đệm sodium acetate pH = 4,8)
- Tốc độ dòng : 0,3 ml/phút; chế độ đẳng dòng
- Thể tích tiêm: 10 L
- Bước sóng: λOrnage II = 492 nm λ2,4-diaminoazobenzen = 437 nm
Đường chuẩn
Chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn có nồng độ 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20 mg/L . Đường chuẩn thể hiện diện tích của tính hiệu phân tích theo nồng độ chuẩn.
Kết quả đường chuẩn với hệ số tương quan R2 từ 0.9991 1 của Orange II và DAB được thể hiện ở bảng 2.
| Hợp chất | Khoảng nồng độ làm việc | Đường chuẩn | Hệ số tương quan (R2) |
| Orange II | 01,0 mg/L | Y= 406763x-271.44 | 0,9999 |
| 2,4-diaminozabenzene | 01,0 mg/L | Y = 4109696x-1586.8 | 1 |
| Orange II | 120 mg/L | y= 413961x- 12529 | 1 |
| 2,4-diaminozabenzene | 120 mg/L | Y = 437899x-24054 | 1 |
Bảng 2. Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của Orange II và 2,4- diaminoazobenzene
Giới hạn phát hiện của DAB, Orange II trên nền mẫu da gà, thịt xá xíu được thể hiện ở
bảng 3.
| Nền mẫu | Hợp chất | C (mg/Kg)* | S/N | LOD (mg/Kg) |
| Da gà | Orange II | 0,230 | 15,5 | 0,045 |
| 2,4-diaminoazobenzene | 0,224 | 14,5 | 0,046 | |
| Thịt quay | Orange II | 0,230 | 16,3 | 0,042 |
| 2,4-diaminoazobenzene | 0,224 | 15,2 | 0,044 |
Bảng 3. LOD của Orange II và 2,4-diaminoazobenzene trên nền mẫu da gà và nền mẫu thịt
quay
* Đã hiệu chỉnh với độ tinh khiết đã cho và dựa trên khối lượng mẫu đã cân
Một số kết quả phân tích trên các nền mẫu
Kết quả phân tích một số mẫu thịt gà, xá xíu, heo quay, thịt vịt, bột gia vị, thực phẩm đã qua chế biến…được lấy ở các chợ và siêu thị trong thành phố Hồ Chí Minh. Orange II và 2,4-diaminoazobenzene phát hiện với nồng độ được thể hiện ở bảng 4.
| Hợp chất | Số mẫu phân tích (mẫu) | Số mẫu phát hiện (mẫu) | % mẫu nhiễm (%) | Khoảng nồng độ mẫu bị nhiễm (mg/kg) |
| Orange II | 99 | 9 (5 mẫu xá xíu, 4 mẫu thit quay) | 9,09 | 0,4 – 10 |
| 2,4- diaminoazobenzene | 101 | 19 (17 m mẫu v ẫu gà, 2 ịt) | 18,81 | 0,1 – 3,0 |
Bảng 4. Kết quả phân tích Orange II và 2,4-diaminoazobenzene của một số mẫu có phát hiện
Định lượng cyclamat bằng sắc ký ion
Hóa chất
Natri cyclamat của Supelco (độ tinh khiết 99,9%) hoặc tương đương
Acid sulfuric đậm đặc (H2SO4) của Merck (Độ tinh khiết 95-97%) hoặc tương đương Sodium Carbonate (Na2CO3) của Merck (độ tinh khiết 99,9%)
Nước cất hai lần
Chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn cyclamat 1000 mg/l: cân 0,11292 g Natri cyclamat hòa tan trong 100 ml bằng nước cất hai lần.
Chuẩn thứ cấp và chuẩn làm việc
Chuẩn thứ cấp 100 mg/l: lấy 10 ml chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất hai lần.
Chuẩn làm việc 0,5, 1, 2, 5 mg/l: lấy lần lượt 0,5, 1, 2, 5 ml chuẩn thứ cấp vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng nước cất hai lần.
Chuẩn làm việc 10, 20, 50 mg/l: lấy lần lượt 1, 2, 5 ml chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng nước cất hai lần.
Dung dịch sử dụng cho suppressor
Kênh acid gồm acid sulfuric 0.1 mol/l: lấy 5,6 ml acid sulfuric đậm đặc vào 1 lít nước cất hai lần.
Kênh nước: nước cất hai lần.
Pha động
Dung dịch Na2CO3 3,6 mmol/l: cân 763 mg Na2CO3 định mức thành 2 lít bằng nước cất hai lần.
Xử lý mẫu
Bước 1: Cân 0,5 g mẫu đã được đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml.
Bước 2: Cho tiếp 10 ml dung dịch acetonitrile:nước (2:8) vào ống ly tâm trên. Lắc 1 phút, siêu âm 10 phút.
Bước 3: ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút.
Bước 4: Chiết phần dịch trong bên trên cho vào bình định mức 50 ml.
Tiến hành chiết thêm hai lần như trên ( bước 2, bước 3, bước 4) và cho vào bình định mức 50 ml trên. Định mức tới vạch bằng nước cất hai lần.
Cột C18 được hoạt hóa bằng 10 ml acetonitril.
Bước 5: Cho mẫu qua cột đã được hoạt hóa, bỏ 3 ml dịch chiết đầu qua cột. Thu lấy 5 ml dịch chiết tiếp theo. Lọc dịch chiết qua đầu lọc 0,22 µm và tiêm vào máy IC.
Điều kiện IC xác định cyclamat
– Column Metrosep A Supp 7 250/4,0
– Injection Volume 20 µl
– Flow 0,7 ml/phút
– Detector conductivity
– Suppression H2SO4 0,1 M
– Eluent Na2CO3 3,6 mM
Đường chuẩn
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ chất chuẩn. Khoảng tuyến tính của cyclamat tính từ LOD đến 50 mg/l.
Định lượng acesulfame k và saccharin bằng sắc ký lỏng đầu dò uv
Hóa chất
Acesulfame K ( Acesulfame potassium 99,0%, Dr.Ehrenstorfer GmbH)
Saccharin ( Acesulfame potassium 99,0%, Dr.Ehrenstorfer GmbH)
Muối K2HPO4 , Zn(CH3COO)2, Na2HPO4, H3PO4 của Merck.
Chuẩn trung gian, dung dịch chuẩn làm việc và hóa chất xử lý mẫu
Dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/l): Cân 10,0 mg chuẩn rắn định mức 10 ml bằng pha động.
Dung dịch chuẩn thứ cấp 1 (250 mg/l): Hút 2,5 ml dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/l) vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng pha động.
Dung dịch chuẩn thứ cấp 2 (100 mg/l): Hút 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/l) vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng pha động.
Dãy chuẩn làm việc có nồng độ 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100; 250 mg/l.
- Hút lần lượt 0,1 ml; 0,2 ml; 0,5 ml; 1ml; 2ml; 5 ml dung dịch chuẩn thứ cấp 2
(100 mg/l) vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng pha động ta được dãy
chuẩn có nồng độ 1,0; 2,0; 5,0; 10; 20; 50 mg/l. - Hút lần lượt 0,5 ml; 1ml dung dịch chuẩn chuẩn làm việc (5 mg/l) vào bình định mức
10ml, định mức đến vạch bằng pha động ta được dãy chuẩn có nồng độ 0,25; 0,5
mg/l.
Muối Zn(CH3COO)2: Cách pha: cân 200 g muối Zn(CH3COO)2 cho vào bình thủy tinh, thêm nước cất để được 1000 g dung dịch Zn(CH3COO)2 20%.
Dung dịch Na2HPO4 bão hòa: Cách pha: Hòa tan muối Na2HPO4 trong 1 lít nước cất cho đến khi dung dịch bão hòa.
Đệm phosphate pH= 3,4: Cách pha: cân 64,4 g muối K2HPO4 cho vào bình thủy tinh chứa khoảng 300 ml nước cất, hòa tan, cho thêm 26 ml H3PO4 và định mức thành 0,5 lít bằng nước cất. Pha loãng 50 lần khi sử dụng, kiểm tra lại pH sau khi pha.
Xử lý mẫu
Bước 1: Cân chính xác khoảng 5,0 g mẫu đã được đồng nhất vào ống 50 ml.
Bước 2: Thêm vào ống chứa các mẫu 30 ml nước cất, lắc đều, đánh siêu âm 10 phút, tiếp tục thêm 5 ml dung dịch Zn(CH3COO)2 20% + 5 ml dung dịch Na2HPO4 bão hòa.
Bước 3: Lắc đều hỗn hợp khoảng 5 phút, ly tâm 10 phút, tốc độ 5000 vòng/phút.
Bước 4: Chuyển toàn bộ phần dung dịch vào bình định mức 100 ml.
Bước 5: Tiếp tục lặp lại các bước thí nghiệm trên lần 2.
Bước 6: Cuối cùng, định mức đến vạch 100 ml bằng nước cất.
Bước 7: Lọc mẫu qua màng lọc 0,45µm thu dịch lọc cho vào vial (pha loãng nếu cần).
Bước 8: Tiến hành đo trên máy HPLC-UV.
Điều kiện HPLC-UV xác định Acesulfame K và Saccharin
Cột sắc ký: Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương đương.
Bước sóng: 220 nm
Pha động: ACN: dung dịch đệm phosphate pH = 3,4 (10:90).
Tốc độ dòng : 1,0 ml/min.
Thể tích tiêm: 10 µl.
Đường chuẩn
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ chất chuẩn.
Định lượng natri benzoat và kali sorbat bằn sắc ký lỏng đầu dò uv
Hóa chất
Natri benzoat (99,5%, Dr.Ehrenstorfer GmbH)
Kali sorbat (99,5%, Dr.Ehrenstorfer GmbH)
Nước cất hai lần khử ion
Acetonitrile
Methanol
Acid Formic
Chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc
Dung dịch chuẩn gốc (500 mg/l): Cân 5,0 mg chuẩn rắn định mức 10 ml bằng H2O.
Dung dịch chuẩn thứ cấp 1 (100 mg/l): Hút 2 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10 ml bằng H2O.
Dãy chuẩn làm việc có nồng độ 1,0 ; 2,0 ; 5,0 ; 10 ; 20 mg/l: Hút lần lượt 0,1 ; 0,2 ;0,5 ; 1,0; 2,0; 5,0 ml dung dịch chuẩn thứ cấp 1 (100mg/l) cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng H2O ta được dãy chuẩn có nồng độ 1; 2 ; 5 ; 10 ; 20 mg/l
Xử lý mẫu
Bước 1: Cân khoảng 5 g mẫu đã được đồng nhất vào ống 50 mL.
Bước 2: Thêm vào 1 ml HCl (1M) và 10 ml H2O.
Bước 3: Vortex cho đều mẫu, đánh siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 4: Chiết mẫu bằng dung môi dietyl eter với 20 ml, vortex mẫu trong 5 phút.
Bước 5: Ly tâm 5 phút, 5000 vòng/phút
Bước 6: Tiến hành chiết mẫu thêm 2 lần, tương tự các bước bước 4 và bước 5 .
Bước 7: Toàn bộ dịch chiết sẽ được cô cạn. Lọc mẫu pha loãng qua màng lọc 13 mm, 0,45µm
Bước 8: Thu dịch lọc cho vào vial
Bước 9: Tiến hành đo trên máy HPLC-UV
Điều kiện HPLC-UV xác định natri benzoat và kali sorbat
Cột sắc ký lỏng pha đảo C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và cột bảo vệ hay tương đương.
Bước sóng: Natri benzoat (225 nm) Kali sorbat (250 nm).
Pha động: 15: 85 (ACN : dung dịch đệm format pH = 4,3)
Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
Thể tích tiêm: 20 µl
Đường chuẩn
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ chất chuẩn.
KẾT LUẬN
Phân tích thành phần của phụ gia thực phẩm là rất quan trọng để đánh giá chất lượng phụ gia thực phẩm.Hiện nay có rất nhiều quy trình phân tích và nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau để phân tích đánh giá chất lượng phụ gia thực phẩm.Để đảm bảo kết quả phân tích được chính xác, các phòng thí nghiệm phải đảm bảo phương pháp phân tích chọn là phù hợp cho đối tượng phụ gia thực phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. QCVN 4 – 12 – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – chất bảo quản, (2010).
[2]. TCVN 8471 – Thực phẩm – xác định Acesulfame K, Aspartame và Saccarin – phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, (2010).
[3]. TCVN 8472 – Thực phẩm – xác định cylamate – phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, (2010).
[4] Nguyễn Thị Xuân Mai, Bài giảng quang phổ hấp thu phân tử, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh, lưu hành nội bộ.
[5] AOAC official method 2007.01 – Pesticide residues in food by acetonitrile extraction and partitioning magnesium sulfate, Gas chromatography/Mass spectrometry and Liquid chromatography/Tanden mass spectrometry.
[6] Beaty R.D., Kerber J.D. – Concepts, Instrumentation and techniques in atomic absorption spectrophotometry, The Perkin – Elmer Corporation, (1993).
[7] QinL., Xiao-Yan Z., Shu-Kun .H et al – Simultaneous High Performance Liquid Chromatographic Determination of Chrysoidine, Auramine O and Safranine T in Food [J]. Food Science 30 (14) 194-196 (2009).
[8] Wang X.,Song G., Wu W., Zhao J., Hu Y – Determination of the Food colorant, Chrysoidine, in Fish by GC/MS, Chromatographia 68 659-662 (2008).
[9] Guui W., Xu Y., Shou L., Zhu G., Ren Y – Liquid chromatography- tandem mass spectrometry for the determination of chrysoidine in yellow-fin tuna, Food Chem 122 1230-1234 (2010).